Mabaka a tšitiso liketsong tsa PCR

Nakong ea karabelo ea PCR, lintlha tse ling tse sitisang li atisa ho kopana.
Ka lebaka la ho ba le kutlo e phahameng haholo ea PCR, tšilafalo e nkoa e le e 'ngoe ea lintlha tsa bohlokoa ka ho fetisisa tse amang liphetho tsa PCR 'me e ka hlahisa liphetho tse fosahetseng.
Mehloli e fapaneng e lebisang liphellong tse fosahetseng le tse mpe ka ho lekana ke ea bohlokoa. Haeba karolo e le 'ngoe kapa tse ngata tsa bohlokoa tsa motsoako oa PCR kapa karabelo ea amplification ka boeona li thibeloa kapa li sitisoa, tlhahlobo ea tlhahlobo e ka sitisoa. Sena se ka lebisa ho fokotseng katleho esita le liphellong tse fosahetseng le tse fosahetseng.
Ntle le thibelo, tahlehelo ea botšepehi ba nucleic acid e reretsoeng e ka hlaha ka lebaka la ho romelloa le/kapa maemo a polokelo pele ho lokisoa sampole. Haholo-holo, mocheso o phahameng kapa polokelo e sa lekaneng e ka lebisa tšenyo ea lisele le nucleic acid. Ho tiea ha sele le lisele le ho kenngoa ha parafini ke lisosa tse tsebahalang tsa ho arohana ha DNA le bothata bo sa feleng (sheba Litšoantšo tsa 1 le tsa 2). Maemong ana, esita le ho itšehla thajana le tlhoekiso e ntle ho ke ke ha thusa.

Setšoantšo sa 1 | Phello ea ho sitisoa ha DNA ho latela botšepehi ba eona
Agarose gel electrophoresis e bontšitse hore boleng ba DNA e arotsoeng likarolong tsa parafini tsa li-autopsies bo ne bo fapana haholo. DNA ea bolelele bo fapaneng ba likaroloana e ne e le teng li-extracts ho latela mokhoa oa ho li lokisa. DNA e ne e bolokoa feela ha e tsitsitsoe lisampoleng tsa tlhaho tse hoamisitsoeng le ho buffered neutral formalin. Tšebeliso ea formalin e nang le asiti e matla ea Bouin kapa e sa buffered, e nang le formic acid e bakile tahlehelo e kholo ea DNA. Karolo e setseng e arohane haholo.
Ka letsohong le letšehali, bolelele ba likotoana bo hlahisoa ka lipara tsa kilobase (kbp)

Setšoantšo sa 2 | Tahlehelo ea botšepehi ba lipheo tsa nucleic acid
(a) Sekgeo sa 3′-5′ hodima dithapo ka bobedi se tla fella ka ho robeha ha DNA e rerilweng. Ho kopanngwa ha DNA ho tla ntse ho etsahala hodima karolo e nyane. Leha ho le jwalo, haeba sebaka sa primer annealing se le siyo karolong ya DNA, ho atoloswa ha mola feela ho etsahala. Tabeng e ntle ka ho fetisisa, dikarolo di ka boela tsa tlala, empa chai e tla ba nyane mme e be ka tlase ho maemo a ho lemoha.
(b) Tahlehelo ea metheo, haholo-holo ka lebaka la ho tlosoa ha purination le ho thehoa ha thymidine dimer, e lebisa ho fokotseheng ha palo ea li-H-bond le ho fokotseha ha Tm. Nakong ea mohato o molelele oa ho futhumatsa, li-primer li tla qhibiliha ho tloha ho DNA ea matrix 'me li ke ke tsa hlola li qhibiliha esita le tlas'a maemo a thata haholo.
(c) Metheo ea thymine e haufi e etsa TT dimer.
Bothata bo bong bo tloaelehileng bo atisang ho hlaha tlhahlobong ea limolek'hule ke ho lokolloa ho fokolang ho feta ho loketseng ha li-nucleic acid tse reretsoeng ha ho bapisoa le ho ntšoa ha phenol-chloroform. Maemong a feteletseng, sena se ka amahanngoa le li-negative tse fosahetseng. Nako e ngata e ka bolokoa ka ho belisa lysis kapa ho sila ha lithōle tsa sele ka enzymatic, empa mokhoa ona hangata o fella ka kutloisiso e tlase ea PCR ka lebaka la ho se lokolloe ha nucleic acid e lekaneng.

Thibelo ea ts'ebetso ea polymerase nakong ea keketseho

Ka kakaretso, thibelo e sebediswa e le mohopolo wa setshelo ho hlalosa mabaka ohle a lebisang diphethong tse sa lokang tsa PCR. Ka kutlwisiso ya biochemical feela, thibelo e lekanyeditswe mosebetsing wa enzyme, ke hore, e fokotsa kapa e thibela phetoho ya substrate-sehlahiswa ka ho sebelisana le sebaka se sebetsang sa polymerase ya DNA kapa cofactor ya yona (mohlala, Mg2+ bakeng sa Taq DNA polymerase).
Likarolo tse sampole kapa li-buffer tse fapaneng le li-extract tse nang le li-reagent li ka thibela enzyme ka ho toba kapa tsa tšoasa li-cofactor tsa eona (mohlala, EDTA), ka hona tsa tima polymerase 'me ka lebaka leo tsa lebisa liphellong tse fokotsehileng kapa tse fosahetseng tsa PCR.
Leha ho le jwalo, dikamano tse ngata pakeng tsa dikarolo tsa karabelo le di-nucleic acid tse nang le sepheo le tsona di bitswa 'dithibela-PCR'. Hang ha botšepehi ba sele bo sitiswa ke ho ikarola mme nucleic acid e lokollwa, dikamano pakeng tsa sampole le tharollo e e potileng le karolo e tiileng di ka etsahala. Mohlala, 'di-scavengers' di ka tlama DNA e le nngwe kapa e nang le marapo a mabedi ka dikamano tse seng tsa covalent mme tsa sitisa ho ikarola le ho hlwekisa ka ho fokotsa palo ya dipheo tse qetellang di fihla sejaneng sa karabelo sa PCR.
Ka kakaretso, li-inhibitor tsa PCR li teng marong a mangata a 'mele le li-reagent tse sebelisoang bakeng sa liteko tsa tlhahlobo ea bongaka (urea morotong, hemoglobin le heparin maling), li-supplement tsa lijo (likarolo tsa tlhaho, glycogen, mafura, li-ion tsa Ca2+) le likarolo tse tikolohong (li-phenol, litšepe tse boima)

Lithibela-PCR tse atileng haholo li ka fumanoa libaktheria le liseleng tsa eukaryotic, DNA e seng ea sepheo, limolek'hule tse tlamang DNA tsa matrices ea lisele le lisebelisoa tsa laboratori tse kang liatlana le polasetiki. Ho hloekisa li-nucleic acid nakong kapa ka mor'a ho ntša ke mokhoa o khethiloeng oa ho tlosa lithibela-PCR.
Kajeno, lisebelisoa tse fapaneng tsa ho ntša tse iketsang li ka nka sebaka sa liprothokholo tse ngata tsa letsoho, empa ho hlaphoheloa le/kapa ho hloekisoa ha lipheo ka 100% ha ho e-so fihlelloe. Lithibelo tse ka bang teng li ka 'na tsa ntse li le teng li-nucleic acid tse hloekisitsoeng kapa li ka 'na tsa se li qalile ho sebetsa. Ho na le maano a fapaneng a ho fokotsa tšusumetso ea lithibelo. Khetho ea polymerase e nepahetseng e ka ba le tšusumetso e kholo mosebetsing oa lithibelo. Mekhoa e meng e pakiloeng ea ho fokotsa thibelo ea PCR ke ho eketsa mahloriso a polymerase kapa ho sebelisa li-additives tse kang BSA.
Thibelo ea liketso tsa PCR e ka bontšoa ka tšebeliso ea taolo ea boleng ba ts'ebetso ea kahare (IPC).
Ho lokela ho nkuwa tlhokomelo ho tlosa di-reagent tsohle le ditharollo tse ding ka hara kit ya ho ntsha, tse kang ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol le phenol, ho tswa ho nucleic acid isolate ka mohato wa ho hlatswa ka botlalo. Ho itshetlehile ka mahloriso a tsona, di ka nna tsa kenya tshebetsong kapa tsa thibela PCR.